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获奖论文一等奖：紫苏肽对免疫低下小鼠免疫功能的影响

朱艳魏颖,王雨辰姜盛郭颖蔡木易谷瑞增

（1.中国食品发酵工业研究院有限公司，北京；2.华狐生物科技（中国）有限公司,辽宁）

摘要目的探究紫苏肽对免疫低下小鼠免疫系统的调节作用。方法采用腹腔注射环磷酰胺（CXT）建立免疫力低下小鼠模型，通过灌胃低、中、高剂量的紫苏肽，检测紫苏肽对免疫低下小鼠T/B淋巴细胞的增殖、NK细胞杀伤力、血清溶血素产生量、巨噬细胞吞噬活性以及血清中细胞因子IL-2和IgG含量的影响。结果紫苏肽能够增加免疫低下小鼠T/B淋巴细胞增殖能力、NK细胞杀伤力、血清溶血素含量、巨噬细胞吞噬能力以及血清细胞因子的含量，并呈现一定的浓度依赖，高剂量的紫苏肽效果最好。结论紫苏肽对免疫力低下小鼠的细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫均具有一定的调节作用。

朱艳

关键词：紫苏肽；免疫调节；环磷酰胺；细胞免疫；体液免疫；非特异性免疫

紫苏是一种重要的经济作物，在我国已经有多年的种植历史[1]。它是典型的药食同源植物，具有抗氧化、抗衰老、降血脂、抗肿瘤等药理功能[2]。年中华人民共和国卫生部将紫苏及其种子列入87种药食两用植物种，充分证明了其食用和药用价值[3]。紫苏籽油脂含量丰富，高达45﹪，常用于制备紫苏油。紫苏籽提油后剩余的紫苏籽粕中蛋白质含量丰富，约为30~45﹪，氨基酸种类齐全，含有8种人体必需氨基酸且必需胺基酸含量与鸡蛋相当，属于优质蛋白[4,5]。但目前紫苏籽粕大部分用作廉价的动物饲料，造成了资源的浪费。

免疫是指机体为了维护自身稳定，排除异己并维持机体稳定性的一种生理机能[6]。免疫系统对于防御病原体是至关重要的，但是免疫系统又会受到压力、不健康的生活习惯、病原体等多种因素的影响，从而引起免疫力低下。免疫力降低不仅增加一些传染病的感染概率，还会增加许多非传染病如衰老、癌症、心血管疾病、抑郁症等的患病几率，严重影响人们的健康生活[7,8,9]。植物蛋白酶解产生的活性肽，它们比蛋白质更容易被人体吸收，且具有更广泛的生理功能，在抗氧化、增强免疫力等方面做出了巨大的贡献[10,11,12]。目前有研究学者对紫苏粕中蛋白质进行酶解，得到具有很强抗氧化活性的多肽，DPPH清除率达到了73.64﹪[2]；贺东亮[13]酶解紫苏蛋白通过超滤分离得到一个七肽能够抑制肿瘤细胞的增殖并促进凋亡，具有较强的抗肿瘤活性。因此，紫苏肽可能具有更强的免疫调节活性。

基于此，我们以本实验室自制的紫苏肽为实验对象，以环磷酰胺（CXT）建立免疫低下小鼠模型，探究紫苏肽的免疫调节作用，为相关食品和保健品的开发奠定基础。

1.材料与方法

1.1材料与仪器

Balb/c6-8周雌性小鼠（许可证：SCXK（京）-）：北京维通利华实验动物技术有限公司；紫苏肽：实验室自制；环磷酰胺：江苏盛迪医药有限公司；左旋咪唑、0.33﹪中性红染色液、0.4﹪台盼蓝、补体、15﹪绵阳红细胞（SRBC）：北京索莱宝生物技术有限公司；小鼠淋巴瘤细胞（YAC-1）：上海冠导生物工程有限公司；CCK-8、红细胞裂解液：碧云天生物技术有限公司；RPMI-培养基、胎牛血清（FBS）：Hyclon公司；脂多糖（LPS）、刀豆蛋白（ConA）：SigmaAldrich公司；TNF-α、IL-2酶联免疫检测试剂盒：北京百智生物科技有限公司。

BDC6流式细胞仪：美国Thermofisher公司；SpectraMR多功能酶标仪：美国Dynex公司；型紫外分光光度计：上海精密科学仪器有限公司。

1.2动物饲养与分组

54只健康雌性Balb/c小鼠，体重18~22g。适应性喂养3d后，随机分为空白组、模型组、阳性对照组（左旋咪唑，灌胃剂量30mg/kg）、紫苏肽低、中、高剂量组，每组6只，分笼饲养。紫苏肽的成人推荐摄入量为3g/60kg，实验中采用人推荐剂量的0.5、1、2倍分别作为紫苏肽灌胃的高（1.2g/kg）、中(0.6g/kg)、低(0.3g/kg)剂量。每天灌胃一次，连续28d。

1.3实验内容

1.3.1免疫力低下小鼠模型的建立

空白组小鼠腹腔注射0.2mL的生理盐水，其余各组腹腔注射40mg/kg的CXT，每天1次，连续3d，此后每隔7d按照剂量为80mg/kg腹腔注射一次进行加强。在造模过程中每天依然灌胃紫苏肽，灌胃28d后，小鼠断食不断水12h后，处死小鼠，进行指标的检测。

1.3.2紫苏肽对小鼠脏器指数的测定

小鼠灌胃28d后，断食不断水12h，称重，解剖取其胸腺和脾脏，计算胸腺指数和脾脏指数：

1.3.3紫苏肽对小鼠T/B淋巴细胞增殖能力的影响

小鼠灌胃28d后，断食不断水12h，拉颈处死，在75﹪酒精中浸泡5min后取出，无菌状态下取其脾脏，研磨，过目尼龙筛，并用PBS冲洗，收集滤液，向其中加入2mL红细胞裂解液，静置2~3min，使红细胞裂解，r/min离心2min，弃上清，PBS清洗2次，将沉淀重悬于RPMI-完全培养基中，即为脾细胞悬液。用台盼蓝进行染色，细胞活性大于95﹪方可用于实验。用RPMI-完全培养基调整细胞浓度为5ⅹ个/mL接种于96孔板中，每孔90μL，每组6个复孔，再向每孔添加10μL的ConA或LPS（终浓度为15μg/mL），分别用于脾细胞向T/B淋巴细胞的转化，将接种好的96孔板置于培养箱中孵育72h，再向每孔加入10μLCCK-8，孵育2h，于酶标仪nm处测定吸光度值。

1.3.4紫苏肽对小鼠NK细胞杀伤力的影响

用RPMI-完全培养基调整脾细胞浓度为5ⅹ个/mL作为效应细胞。YAC-1细胞用RPMI-完全培养基培养，待细胞生长为对数期，用台盼蓝染色确定细胞活性大于95﹪即可用于实验。调整细胞浓度为1ⅹ个/mL作为靶细胞，保证效靶比为50：1，向U型96孔板每孔添加μL的效应细胞和μL的靶细胞，每组6个复孔，设置靶细胞对照孔和效应细胞对照孔，靶细胞对照孔中加入μL靶细胞悬液和μL完全培养基，效应细胞对照孔中加入μL效应细胞悬液和μL完全培养基，于培养箱中孵育4h，再向每孔添加10μLCCK-8，继续孵育2h，于酶标仪nm处测定吸光度值。

1.3.5紫苏肽对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响

小鼠灌胃25d后，每组取3只小鼠腹腔注射1mL6﹪淀粉肉汤溶液，诱导产生巨噬细胞。灌胃28d后，小鼠断食不断水12h，拉颈处死并在75﹪酒精中浸泡5min，随后在无菌工作台上剥离腹部皮肤，注意不要弄破腹腔膜，用无菌注射器向小鼠腹部注射3mLPBS，轻柔腹腔膜，收集腹腔液，r/min离心3min，收集沉淀，并用PBS离心清洗2次，最后将细胞重悬于RPMI-完全培养基中，即为巨噬细胞悬液。用台盼蓝对进行染色确定细胞活性大于95﹪即可用于实验。将细胞接种在细胞培养瓶中，在培养箱中培养2h使其贴壁，弃掉未贴壁的细胞，收集贴壁细胞，调整细胞浓度为5ⅹ个/mL，接种于96孔板，每孔μL，每组6个复孔，在培养箱中24h使其贴壁，再每孔加入μL0.1﹪中性红溶液，继续培养1h，用PBS洗去培养液中的中性红，每孔加入μL细胞裂解液(含体积分数1﹪的乙酸和50﹪的乙醇)，室温放置2-3h，细胞溶解后，用酶标仪测定nm处吸光度值，空白组为灌胃生理盐水小鼠腹腔巨噬细胞。

1.3.5紫苏肽对小鼠血清血溶素含量的影响

每组取3只小鼠，灌胃24d后，腹腔注射0.2mL5﹪SRBC诱导产生过敏反应，灌胃28d后，对小鼠进行眼角采血，分离血清。用生理盐水将血清稀释倍，取血清样品1mL、10﹪SRBC0.5mL、1mL补体于试管中，对照孔用生理盐水代替血清，37℃水浴加入30min，冰浴终止反应，离心取上清，用紫外分光光度计测定nm处吸光度值。结果用OD值表示。

1.3.6紫苏肽对小鼠血清细胞因子IgG、IL-2的影响

小鼠灌胃28d后，断食不断水12h，摘眼球采血，分离血清，用IgG和IL-2酶联免疫试剂盒测定血清中二者的含量。

2.实验结果

2.1紫苏肽对免疫器官的影响

小鼠注射CXT后脾脏指数和胸腺指数均发生降低，说明免疫低下小鼠模型建立成功。紫苏肽能够减轻CXT引起的免疫器官衰减现象，并且随着紫苏肽灌胃浓度升高，小鼠免疫器官衰减量减少，高剂量的紫苏肽效果与阳性药物可媲美。

图1紫苏肽对免疫低下小鼠免疫器官的影响

Fig.1EffectofPerillapeptidesonimmuneorgansinimmuno