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摘要：目的探讨植物的形态特征及ITS2、psbA-trnH序列在薄荷及其近缘物种鉴定中的应用，为薄荷及近缘物种的鉴定提供参考。方法观察薄荷及其近缘物种叶片形状、叶缘形状、绒毛密度、腺鳞密度等形态特征并对供试材料ITS2序列、psbA-trnH序列进行PCR并测序，通过对比植物形态特征、分析DNA序列、计算遗传距离、构建邻接树等方法对数据进行整理分析，并对植物进行鉴定。结果植物的形态特征结合ITS2序列、psbA-trnH序列构建的邻接树显示香水薄荷与夏香薄荷、丹参与紫苏、胡椒薄荷与美国薄荷、大叶薄荷与猫薄荷亲缘关系近，该方法能将薄荷及其近缘物种区分。结论ITS2序列、psbA-trnH序列可作为薄荷及其近缘物种的DNA条形码，与叶的形态特征相结合鉴定效果更佳。

薄荷为唇形科植物薄荷MenthahaplocalyxBriq.的干燥地上部分，始载于《新修本草》，具有疏散风热、清利头目、利咽透疹、疏肝行气的功效，是一味临床常用的辛凉解表药[1]。薄荷分布范围广、种类多，产于南北各地，有性和无性繁殖并存，且易与唇形科植物杂交，由此造成薄荷品种混乱，引起临床用药的困难。如何科学准确地鉴别薄荷及其近缘物种就变得十分重要。过去常用形态学分类或分子标记技术对薄荷的种质资源进行鉴定和评价。王少铭等[2]对贵州及周边省份的留兰香及野生薄荷资源的遗传多样性进行了研究，梁呈元等[3]采用ISSR标记技术证明了薄荷属种质资源存在丰富的遗传多样性，乐云辰等[4]从分子水平对上海地区的薄荷品种进行了种质资源的评价。目前，尚无薄荷及其近缘物种资源叶片的形态特征与分子研究相结合的报道，本实验在前人研究的基础上将叶的形态特征与分子技术相结合，以期为薄荷及其近缘物种建立更为完善的区分机制，为薄荷及近缘物种的鉴定提供参考。

DNA条形码（DNAbarcoding）技术是当前生物学研究热点之一[5]，国内外应用DNA条形码鉴定中药材基原物种及其混伪品的研究已有广泛的报道[6-10]，Techen等对条形码、可用的数据库进行了综述，Cheng等[8]通过测序对中药制剂的生物成分进行了分析。Chen等[11]通过大量的分析，最终确定ITS2作为鉴别药用植物及其近缘种的标准DNA条形码，同时也推荐叶绿体基因间隔区片段psbA-trnH作为补充条形码。本研究以薄荷及其近缘物种为研究对象，扩增了其核糖体DNA的ITS2序列及叶绿体DNA的psbA-trnH序列，结合部分GenBank数据，采用邻接法（NJ）构建系统聚类树，并结合植物叶片的形态特征进行鉴别，以期为薄荷的质量控制提供科学参考。

1仪器与材料

1.1仪器

基恩士数码成像系统（VHX-）；PCR仪（Veriti96WellThermalCycler）；凝胶成像系统（OSTC）；高速离心机（EppendrofCentrifugeR）；各种量程的微量移液器（德国Eppendorf公司）。

1.2试剂

植物基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司，批号DP-02）；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；所用试剂均为分析纯。

1.3材料

植物样本27份，均来自河北中医学院中药材种植基地，经河北中医学院郑玉光教授鉴定为薄荷及其近缘物种，凭证标本保存于河北中医学院植物药材标本馆，其余各基原物种DNA序列均来源于GenBank数据库。材料来源及样品信息见表1。

2方法

2.1样品的采集

取样本植物资源幼嫩的新鲜叶片液氮冷冻，用于DNA提取。另取植株中部健康叶片用于性状观测。凭证标本存放于河北中医学院标本馆。

2.2性状观测

选取供试植株的同龄健壮叶片使用基恩士数码成像系统进行性状观测。

2.3DNA提取

取新鲜叶片进行洁净处理，液氮迅速磨成细粉。DNA提取按试剂盒（北京天根生化科技有限公司，批号DP-02）说明步骤进行提取，部分操作进行相应调整（温育时间延长至40min；第一步加入GP1时同时加入CTAB）。

2.4PCR扩增及测序

引物由上海生工有限公司合成（表2）。PCR反应体系为20μL，包括2×TapPCRMix10μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，ddH2O7μL，DNA模板2μL。反应程序：94℃（预变性5min），94℃（变性30s），56℃（退火30s），72℃（延伸45s），40个循环，72℃（后延伸10min）[12]。PCR产物用琼脂糖，1×TAE缓冲液，凝胶成像系统成像记录，PCR产物送上海生工有限公司进行双向测序，测序引物与PCR引物相同。

2.5数据处理

获得的ITS2、psbA-trnH测序峰图用BioEdit查看峰形质量，确保质量合格后将序列进行校对拼接，去除引物及低质量区，基于隐马尔科夫模型的Hmmer注释方法去除5.8S和28S区段，获得ITS2间隔区序列及psbA-trnH序列，MEGA5.0（Molecularevolutionarygeneticsanalysis）进行分析，利用邻接法（neighbour-joining，NJ）构建系统聚类树。

3结果与分析

3.1薄荷及其近缘物种种质资源外部形态性状

由图1可以看出，收集到的种质资源的形态性状丰富多样、类型广泛。对收集到的种质资源的叶片形状进行观察。其中，丹参、猫薄荷及紫苏叶片形状呈卵圆形，其余种质资源叶片均为不同程度的椭圆形状。猫薄荷、留兰香及胡椒薄荷叶片皱缩程度明显，薄荷及紫苏叶面平整，皱缩程度最小。除美国薄荷、胡椒薄荷及柠檬薄荷叶缘锯齿较尖锐外，其余品种叶缘锯齿均圆钝。胡椒薄荷叶片深绿色，其余品种颜色较浅。观察叶片表面叶绒毛的密度，按1～5分为5个等级，密度依次增大，丹参叶片绒毛密度为5，胡椒薄荷、柠檬薄荷、夏香薄荷、野薄荷、美国薄荷为4，猫薄荷、薄荷为3，香水薄荷、大叶薄荷为2，留兰香及紫苏为1。与陈*[13]的研究结果一致。紫苏叶脉呈紫色，其余叶脉均为淡绿色，有不同程度的绒毛包被。

观察可见叶片下表面有密度不等的凹点状腺鳞分布（图2），按1～5分为5个等级，密度依次增大，其中，大叶薄荷、猫薄荷、紫苏、留兰香、薄荷、香水薄荷下表面腺鳞密度记为5，柠檬薄荷、夏香薄荷记为4，丹参、美国薄荷记为3，野薄荷、美国薄荷及胡椒薄荷在相同视野下的腺鳞数量最少，记为1。且大叶薄荷、猫薄荷及紫苏腺鳞沿叶脉分布，其余品种植物腺鳞在叶片各处散在分布。此外，丹参、胡椒薄荷、柠檬薄荷、夏香薄荷、香水薄荷叶片表面有浓密的绒毛包被，其余品种仅有少量绒毛或无绒毛包被（表3）。

3.2薄荷及其近缘物种遗传距离

根据K2P遗传距离计算（表4），薄荷及各近缘物种间的遗传距离为0.～0.，采集样品中胡椒薄荷、柠檬留兰香、美国薄荷、野薄荷间遗传距离最小，为0，其亲缘关系最近，有可能为一个种。胡椒薄荷、柠檬留兰香、美国薄荷、野薄荷与夏香薄荷的遗传距离最大，为0.，亲缘关系最远。其中留兰香与薄荷的遗传距离较近（0.），大叶薄荷与薄荷的遗传距离较远（0.），结果表明，留兰香的变异程度较小，与薄荷亲缘关系最近。

3.3聚类分析

对测序成功的序列在NCBI网站进行BLAST相似性检索，均有较好的匹配度，确认为目标序列。为使实验结果更加清晰，加入GenBank下载的相关序列（G-BH、G-XS、G-XX、G-HJ、G-MG、G-NM、G-ZS、G-DY、G-M），构建NJ树。

基于ITS2序列构建薄荷及其近缘物种间的NJ系统聚类树（图3）中发育树主要分为4支，薄荷、香水薄荷各自单独聚为一支。大叶薄荷、柠檬薄荷、猫薄荷、丹参、紫苏、种植薄荷、留兰香聚为一支，其中种植薄荷与留兰香亲缘关系较近，聚为一支；丹参与紫苏亲缘关系较近，聚为一支。夏香薄荷、胡椒薄荷、美国薄荷聚为一支，与上述物种亲缘关系较远。

基于psbA-trnH序列构建薄荷及其近缘物种间的NJ系统聚类树（图4）。从聚类树上可以看出，薄荷及其近缘物种分为3支，其中香水薄荷、夏香薄荷、柠檬薄荷、薄荷、丹参、紫苏聚为一类，野薄荷、柠檬留兰香、胡椒薄荷、美国薄荷聚为一类，大叶薄荷与猫薄荷聚为一类，各支支持率较高，表现出良好的单系性。结果表明，ITS2和psbA-trnH均能作为薄荷及其近缘物种的DNA条形码，其中psbA-trnH较ITS2更为保守。

4讨论

微性状鉴别是性状鉴定向微观领域的延伸，通过观察、拍摄药材表面的细微特征信息达到鉴别的目的[14]。本研究通过对收集的薄荷及其近缘物种种质资源的微性状进行观察、统计发现薄荷属植物外部形态变异广泛，遗传多样性十分丰富，在叶片性状、皱缩程度、叶表面绒毛密度、叶的边缘形状、叶脉颜色等性状上表现出差异，因此可通过微性状区分薄荷及其近缘物种。根据叶绒毛密度对薄荷及其近缘物种分类，结果显示胡椒薄荷、柠檬薄荷、夏香薄荷、野薄荷、美国薄荷归为一类，猫薄荷与薄荷归为一类，香水薄荷与大叶薄荷归为一类，留兰香与紫苏归为一类，丹参自为一类。

腺鳞是特化的腺毛组织，腺鳞的分泌细胞外侧存在致密的角质层，角质层与分泌细胞所形成的空腔为腺毛的分泌物提供了储存场所[15]。薄荷腺鳞是一个完整的植物组织，受到整体植株调控[16]，因此腺鳞能够指示薄荷及近缘物种的性状差别，能够作为薄荷及其近缘物种的鉴定依据。本研究对腺鳞进行观察统计，结果显示大叶薄荷、猫薄荷、紫苏、留兰香、薄荷及香水薄荷聚为一类，柠檬薄荷与夏香薄荷聚为一类，野薄荷、胡椒薄荷与美国薄荷聚为一类，丹参自为一类。与叶的绒毛密度为标准的分类结果相一致，再次证明此分类方法能够作为薄荷及其近缘物种的鉴定依据。

薄荷分布广泛、种类多、有性与无性繁殖并存，再加上生态环境的影响，造成薄荷的鉴别困难[17]，植物DNA序列现被大量应用于药材的分子鉴定，目前已成为植物分类和鉴定研究的热点[18]，对于亲缘很近的物种，单一片段的分析存在局限性，应用多个片段结合的方法可以获得更全面的信息[19]，为了更好地解决薄荷鉴定难的问题，本研究在微性状鉴别的基础上，应用ITS2条形码及psbA-trnH条形码对测序成功的薄荷及其近缘物种的序列进行分析对比研究，与庞晓慧等[17]研究结果不同，薄荷与胡椒薄荷亲缘关系较远，而与留兰香的亲缘关系较近。本研究结果表明薄荷与留兰香的亲缘关系近于薄荷与胡椒薄荷的亲缘关系。同时，结果显示香水薄荷与夏香薄荷亲缘关系近，丹参与紫苏亲缘关系近，胡椒薄荷与美国薄荷亲缘关系近，大叶薄荷与猫薄荷亲缘关系近。结果表明该条形码能够有效地将薄荷及其近缘物种区分开，进一步验证了ITS2结合psbA-trnH序列可以作为薄荷鉴定的DNA条形码。

参考文献（略）来源：苏畅，蔺应雪，王乾，侯芳洁，张兰兰，马东来，郑玉光，郑开颜.薄荷及其近缘物种叶的形态特征及DNA条形码鉴定研究[J].中草药,,50(15):-.预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇